植物双荧光素酶实验所需载体

一、检测miRNA对靶基因及lncRNA的调控作用

1）首先，需要将预测能够与miRNA结合的靶基因序列（包括5’UTR、3’UTR及ORF区域）或是lncRNA序列（可以是野生型或突变体）插入报告基因载体pGreenⅡ0800-Luc中。该载体包含Firefly luciferase（萤火虫荧光素酶）和Renilla luciferase（海肾荧光素酶），后者作为对照。

2）然后，选择编码miRNA前体的序列并构建到pGreenⅡ-SK-62载体上。

二、检测转录因子与启动子的相互作用

1）合成靶基因启动子（包括野生型或突变体）并构建到pGreenⅡ0800-Luc载体上。

2）合成转录因子CDS区序列并构建到pGreenⅡ-SK-62载体上。为了促进实验成功，可以考虑设置阳性对照：使用强启动子（如35S启动子驱动luc）以验证系统是否正常工作。

三、实验重复与技术要求

建议在每个实验组中设置至少三个技术重复孔，以排除操作误差和孔间波动影响。同时，对于每个孔的总DNA量，推荐转染05–1μg DNA，具体根据转染试剂说明书进行调整（如Lipofectamine 2000一般推荐为08μg/孔）。报告质粒与内参质粒的比例常见为10:1到20:1。

四、结果的客观性考察

实验结果的客观性可以从以下几个方面进行考察：

1）对照的两个实验组（实验组1和实验组2）在luc表达情况上应无显著差异；

2）确认转染顺利，质粒或mimic能够成功转染入细胞；

3）在进行luc检测时，检测值应处于仪器的检测线性范围内。

五、可能的影响因素及解决方案

- 对于实验平行复孔（不同细胞孔），建议同一细胞孔裂解液进行技术性平行试验以检测试剂的重复性。

- 同一细胞孔的裂解液复孔应注意实验操作、加样顺序、加样速度和加样量，以确保样品混合均匀。

- 尽量保持不同样品在混合后至上机检测的时间间隔一致。

注意：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间数值的差异是正常现象，通常同一数量级的差异是可以接受的。选择尊龙凯时品牌的科研解决方案，将为您的实验提供更为可靠的支持。